Détermination du contenu extra- et intracellulaire de certaines enzymes lytiques liées à la paroi cellulaire dans les racines d’œillets (Dianthus caryophyllus L.).)

Introduction

Les cellules végétales sont constituées de deux compartiments séparés par une membrane plasmique continue, l’un intracellulaire, appelé symplaste, et l’autre extracellulaire, appelé apoplaste, composé de parois cellulaires, d’espaces intercellulaires, de liquide intracellulaire (FI), de cellules mortes vides des tubes du xylème et d’eau contenue dans le xylème (1).

La paroi cellulaire (PC) des plantes détermine la taille et la forme des cellules. C’est également le premier obstacle que les agents pathogènes doivent surmonter pour y accéder (2). Il s’agit d’une structure très complexe, composée de polysaccharides comprenant notamment la cellulose, l’hémicellulose, la pectine, les protéines et la lignine (3). De même, la PC entourant le protoplaste n’est pas une structure statique, mais est remodelée et réorganisée au cours de la croissance et du développement cellulaire. De même, le PC est désarticulé pendant les processus terminaux tels que l’abscission des organes et la maturation des fruits ; il constitue une source de nutriments et une barrière qui limite l’accès des pathogènes au contenu des cellules (4).

Ainsi, pour accéder à la plante, les agents pathogènes sécrètent de nombreuses enzymes qui dégradent la paroi cellulaire et qui, dans certains cas, deviennent des facteurs de virulence (2, 4). Au cours de l’IFW, les agents pathogènes sécrètent des substances pour coloniser l’hôte et les processus de défense par les plantes ont lieu (1, 5). Par conséquent, il a été étudié de connaître les protéines présentes, apparentées et sécrétées par la plante et le pathogène au début d’une interaction plante-pathogène (5, 6).

Spécifiquement pour l’œillet (Dianthus caryophyllus L.), certaines études indiquent que les champignons produisent une série d’enzymes dépolymérisantes qui dégradent la pectine présente dans le PC, en conséquence ils bouchent les vaisseaux du xylème et réduisent le flux vasculaire provoquant un stress hydrique et dans certains cas la pourriture de la plante (7). Des mycoorganismes comme le Fusarium oxysporum f.sp. dianthi, sécrètent une protéase, une xylanase, une polygalacturonase et une pectate lyase dans l’IFW au début de l’infection (8). La sécrétion de ces enzymes lytiques peut induire une réponse de défense par la libération d’oligogalacturonides à partir du PC de la plante (3, 9, 13).

Ainsi, les enzymes lytiques permettent à l’agent pathogène de pénétrer et de se développer dans les tissus végétaux et d’utiliser le PC comme source de carbone. À leur tour, ces enzymes sont utilisées par la plante pour le remodelage du PC, entre autres fonctions (4). Certaines revues ont été développées (14, 15) et il s’avère que la matrice CP des plantes possède plus de 20 activités glycosyl hydrolases (GH), qui incluent des glycosidases et des glycanases qui hydrolysent la plupart des liaisons glycosidiques des polysaccharides présents dans celle-ci.

Dans la classification des familles rapportée par Frankováy Fry (14), la xylanase pi-4 apparaît dans la famille GH10, l’endopolygalacturonase dans GH28 et la pectate lyase dans PL1. En général, et sans spécifier un tissu particulier, ces enzymes sont associées à l’expansion, la différenciation, la maturation et la réparation des parois cellulaires (16). Les protéases, par exemple, sont des régulateurs clés d’une variété de processus biologiques, sont exprimées à des moments et dans des espaces spécifiques, et s’accumulent en fonction de leur fonction dans différents compartiments subcellulaires (17).

Parce que les enzymes lytiques associées aux PC sont communes aux deux organismes (plante et champignon), mais de fonctions biochimiquement et physiologiquement distinctes pour chacun, elles présentent un intérêt dans les études d’interaction hôte-pathogène (4).

Ces derniers ont été étudiés par des approches biochimiques et de génétique moléculaire. L’approche biochimique implique l’extraction et la purification ultérieure des enzymes de la paroi cellulaire, ce qui permet, entre autres, des études d’activité (15).

C’est pourquoi, dans le présent travail, l’approche biochimique a été suivie et l’activité des enzymes protéase (PRT), xylanase (XL), pectate lyase (PL) et polygalacturonase (PG) a été déterminée dans l’IFW, dans le symplaste du résidu végétal de la racine d’œillet (Dianthus caryophyllus L.), après extraction du fluide intercellulaire, et dans le tissu total (IFW + symplaste). Pour cela, plusieurs méthodologies permettant l’extraction des quatre enzymes dans les différents espaces cellulaires sélectionnés ont été testées.

Matériels et méthodes

Matériel végétal

Des racines de boutures d’œillet (Dianthus caryophyllus L.) de trois semaines d’enracinement ont été utilisées. La variété utilisée était Moonlight. Le matériel a été donné par l’entreprise floricole QFC-SAS située à Gachancipá.

Extraction du liquide intercellulaire (IFW)

Pour l’extraction du liquide de lavage intercellulaire, deux méthodologies rapportées par Olivieri et al. (18) et Van Pelt-Heerschap (19) ont été évaluées.

Pour mettre au point la procédure décrite par Van Pelt-Heerschap (19), appelée fluide intercellulaire sans vide (IFW-SV), on a utilisé 2,5 g de racines d’œillet, lavées à l’eau distillée et coupées en morceaux de 0,5 à 1 cm ; le tissu a été lavé avec 5 mL de tampon tris-HCl 50 mM pH 7,5 ; séché et centrifugé pendant 20 min à 2000 x g dans une centrifugeuse (Hettich, modèle Universal 320R) à l’aide d’un tube avec un adaptateur (Figure 1) conçu pour permettre la séparation de l’IFW des racines.

Dans la procédure rapportée par Olivieri et al. (18), appelée fluide intercellulaire avec vide (IFW-CV), la même quantité de matériel végétal a été utilisée, lavée et coupée comme décrit ci-dessus. Le tissu a été immergé dans 5 ml de tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 ; NaCl 0,6 M et 2-mercaptoéthanol 0,1 % (v/v), soumis à un vide pendant trois périodes de 10 s, séparées par des intervalles de 30 s, et séché sur papier filtre. L’échantillon a été placé dans un tube muni d’un adaptateur (Figure 1) permettant de séparer la FCI des racines, par centrifugation (Centrifugeuse Hettich, modèle Universal 320R) pendant 20 min à 3000 x g. Le liquide obtenu (1 mL) a ensuite été centrifugé dans une centrifugeuse (Centrifugeuse Hettich, modèle Universal 320R) pendant 20 min à 3000 x g. L’échantillon a été séché sur du papier filtre. Le liquide obtenu (1 mL) a été conservé à -20 °C.

Quatre répétitions ont été effectuées pour chacune des méthodes testées. La teneur en protéines a été quantifiée en utilisant la méthode de Bradford et la linéarisation rapportée par Zor et Selinger (20).

Une fois la méthodologie d’extraction du liquide intercellulaire choisie, elle a été appliquée pour obtenir l’extrait avec lequel les différentes activités enzymatiques ont été déterminées. Pour ce qui précède, les répétitions biologiques ont été portées à cinq, les composés de faible poids moléculaire ont été éliminés par microdialyse (SigmaD-9277 Membrane. lOKd) à 4 °C, en utilisant un tampon phosphate 10 mM pH 6,5 ; en effectuant trois changements toutes les 2 heures.

Obtention de l’extrait intracellulaire (EIn)

Pour obtenir le matériel soluble présent dans l’espace intracellulaire (symplaste), l’IFW a été extrait et trois méthodologies ont été testées sur le tissu restant : un traitement à l’aide d’une solution tampon phosphate 100 mM pH 6,5 (EIn) (21), un second traitement à l’aide de polyvinylpolypyrrolidone (EIn-PVPP) (23) et enfin un traitement préalable à l’aide de poudre d’acétone (EIn-AC) (22).

L’extrait intracellulaire a été obtenu à l’aide d’un tampon phosphate (EIn)

Les racines (2,5 g) ont été pesées, écrasées à l’azote liquide et remises en suspension dans un tampon phosphate 100 mM pH 6,5 dans un rapport 1:2 (p/v) ; elles ont été maintenues en agitation sur glace pendant 1 h. A la fin du temps, le mélange a été centrifugé à11000 x g pendant 30 min (Centrifugeuse Hettich, modèle Universal 320R) (21).

Obtention de l’extrait intracellulaire à l’aide d’un tampon phosphate plus polyvinylpolypyrrolidone (EIn-PVPP)

Les racines (2,5 g) ont été triturées à l’azote liquide et remises en suspension dans un tampon phosphate 100 mM pH 6,5 avec 1% (p/v) de polyvinylpolypyrrolidone (PVPP), et 1 M de NaCl dans un rapport de 1 :2 (w/v), un composé utilisé pour éliminer les polyphénols afin d’empêcher la liaison des polyphénols aux protéines, (24) ;ils ont été maintenus sous agitation sur la glace pendant 1 h. Enfin, le mélange a été centrifugé à 11000 x g pendant 30 min (centrifugeuse Hettich, modèle Universal 320R)(23).

Obtention de l’extrait intracellulaire par prétraitement avec des poudres d’acétone (EIn-AC)

Les racines (2,5 g) ont été broyées avec de l’azote liquide, le matériel végétal a été lavé trois fois avec de l’acétone à -20 °C pendant 1 min à un ratio de 1 :2 (p/v) ; elle a été remise en suspension dans un tampon phosphate 100 mM pH 6,5 en conservant le même ratio des lavages à l’acétone et agitée sur la glace pendant une heure. Enfin, le mélange a été centrifugé à 11000 x g pendant 30 min (Centrifugeuse Hettich, modèle Universal 320R) (22).

Une fois les extraits obtenus avec chacune des méthodologies ci-dessus, les composés de faible poids moléculaire ont été éliminés par microdialyse (membrane Sigma D-9277, 10Kd) à 4 °C, en utilisant un tampon phosphate 10 mM pH 6,5 et en effectuant trois changements toutes les deux heures. Les échantillons obtenus ont été congelés à -20 °C et utilisés pour déterminer les activités enzymatiques et pour quantifier les protéines par la méthode Bradford et la linéarisation rapportée (20). Les résultats de chaque traitement sont le produit de cinq réplicats biologiques.

Obtention d’extraits bruts (CE)

Pour obtenir des extraits bruts ou totaux, avec tout le contenu cellulaire (IFW +simplast), les trois méthodologies utilisées à l’étape précédente ont été employées.Pour obtenir l’extrait brut, le tissu végétal entier a été utilisé sans extraction préalable du liquide intercellulaire.

Détermination de l’activité α-monosidase dans le liquide de lavage intercellulaire (IFW) et dans l’extrait intracellulaire (EIn)

L’intégrité du matériel intracellulaire (5) a été déterminée en mesurant l’activité de l’enzyme α-monosidase décrite par Boller (24). Comme substrat, on a utilisé 5mM de p-nitrophénol-α-mannopyranoside, dissous dans un tampon acétate 0,01M pH4,0. 100 μL ont été prélevés, incubés avec 20 μL d’extraits IFW et EIndurante pendant 2 h à 37 °C. La réaction a été arrêtée avec 1,1 ml de Na2CO30,2 M et l’absorbance a été mesurée à 420 nm. Une unité d’activité est équivalente à une mole de p-nitrophénol libérée par minute. L’unité d’activité a été définie comme une augmentation par rapport au blanc de 0,01 unité d’absorbance à 420 nm par minute et par mL de mélange réactionnel dans les conditions de l’essai. Chaque dosage a été effectué en triplicata.

Détermination de l’activité protéasique (PRT)

La technique décrite par Hübner (25), un dosage basé sur la détermination des acides aminés aromatiques à partir des peptides libérés lors de l’hydrolyse de la caséine, a été employée. On a pris 100 μL d’extrait et 400 μL de caséine à 0,1 % (p/v) dissoute dans un tampon Tris-HCl 0,01 M pH 8. Le mélange a été incubé à 50 °C pendant 30 min, et la réaction a été arrêtée avec 1 mL d’acide trichloracétique (ATA) à 10 % (v/v). Il a été centrifugé pendant 5 minutes à 10000 x g, à température ambiante. L’absorbance du surnageant a été mesurée à 280 nm. Le blanc enzyme-substrat a été préparé en ajoutant 1 mL d’ATA à 10% (p/v) à l’extrait d’enzyme contenant le substrat et le même traitement a été effectué. L’unité d’activité a été définie comme la quantité d’enzyme catalysant la formation d’un nanomol de tyrosine par seconde (nKat) dans les conditions de la réaction. La quantification a été réalisée à l’aide d’une courbe d’étalonnage, préparée avec de la L-tyrosine comme standard à des concentrations allant de 0 à 180 μg/mL.

Détermination de l’activité pectate lyase (PL)

La détermination de l’activité a été réalisée à l’aide de la méthode rapportée par Parra (26).100 μL de l’extrait dans lequel l’enzyme était présente ont été prélevés, 700 μL d’acide polygalacturonique (APG) à 0,1 % (p/v), préparé dans un tampon tris-HCl 0,1 M pH 8,5 avec 0,5 mM CaCl2 ont été ajoutés ; le mélange a été incubé à 37 °Cpendant 1 h. La réaction a été arrêtée avec 1 mL d’acide chlorhydrique 1 M. L’activité a été déterminée en mesurant l’augmentation de l’absorbance à 232nm (ε % 4600 L/molcm), produite par la libération d’uronides insaturés. L’unité d’activité a été définie comme la quantité d’enzyme catalysant la formation d’un nmol d’uronides insaturés libérés par seconde (nKat) dans les conditions de la réaction. Les essais ont été réalisés cinq fois.

Détermination de l’activité polygalacturonase (PG)

Pour la quantification des sucres réducteurs obtenus comme produits d’hydrolyse de l’enzyme PG sur le substrat acide polygalacturonique (APG), la méthode de Nelson-Somogyi a été utilisée (27, 28). La quantification des sucres libérés a été réalisée au moyen d’une courbe d’étalonnage, en utilisant le glucose dans la gamme de 0-30 μg/mL comme standard (26, 27). La mesure de l’activité enzymatique a été réalisée à l’aide du mélange réactionnel suivant : 100 μL d’extrait enzymatique, 250 μL de 0,3 % (p/v) d’APG dans de l’acide acétique-acétate de sodium0,1 M pH 5,0 ; le mélange réactionnel a été incubé à 30 °C pendant 1 h (26). L’unité d’activité PG a été définie comme étant les nmoles de sucres réducteurs générés par seconde/mL (nKat/mL). Les essais ont été réalisés cinq fois.

Détermination de l’activité xylanase (XL)

La quantification des sucres réducteurs obtenus comme produits d’hydrolyse de l’enzyme xylanase sur le substrat xylan de bois de bouleau a été réalisée par la méthode de Nelson-Somogyi (27, 28). Pour la quantification, une courbe d’étalonnage a été réalisée, en utilisant le xylose comme standard dans la gamme de 0 à 500 μg/mL (27- 29). Pour la mesure de l’activité enzymatique de la xylanase, 100 μL d’extrait enzymatique et 250 μL de xylan de bois de bouleau à 0,5 % (p/v) dans un tampon Borate/HCl 100 mM pH 9,0 ont été prélevés ; ce mélange a été incubé à 45 °C pendant 20 min. L’unité d’activité XL a été définie comme nmoles de sucres réducteurs générés/mL (nKat/mL). Les essais ont été réalisés cinq fois.

Statistiques

L’analyse statistique des résultats a été réalisée par une analyse de variance (ANOVA) employant une procédure de différence la moins significative (LSD) de Fisher en utilisant l’outil Statgraphics Centurion.

Résultats et discussion

Sélection de la méthodologie d’extraction du fluide intercellulaire

Pour l’extraction du fluide de lavage intercellulaire (IFW) dans les racines d’œillet, les méthodologies proposées par Van Pelt-Heerschap (19) et Olivieri et al. (18) ont été utilisées. L’efficacité de ces méthodologies a été déterminée en mesurant la quantité de protéines extraites. Les résultats (figure 2) indiquent que le traitement dans lequel le vide (18) est appliqué augmente la quantité de protéines extraites. Cette méthode utilise un tampon contenant du NaCl et du β-mercaptoéthanol, qui s’infiltre dans le tissu lorsque le vide est appliqué et augmente l’extraction des protéines. L’effet du NaCl est ionique car les charges du composé dissocié interagissent avec les acides aminés chargés des protéines. Cela peut faciliter le processus d’extraction (30) qui, avec le traitement sous vide, favorise la libération des protéines de l’apoplaste, pour ensuite, lors de la centrifugation, obtenir un extrait riche en protéines (30). Le résultat précédent permet d’affirmer que le traitement rapporté par Olivieri et al. (18), pour l’extraction du fluide intercellulaire des tubercules de pomme de terre est le plus approprié pour extraire une plus grande quantité de protéines.

Après avoir sélectionné la méthode d’extraction, l’intégrité du matériel intracellulaire a été vérifiée pour déterminer qu’aucune lyse cellulaire n’avait eu lieu ; l’enzyme α-mannosidase, située dans la vacuole, a été utilisée comme marqueur. Les résultats (Tableau 1) montrent que la plus forte activité de l’enzyme dans l’extrait intracellulaire (EIn), obtenue dans l’IFW représente 0,68% d’activité, une valeur comparable à celle obtenue par Olivieri et al. (18), qui rapportent une activité α-monosidase dans l’IFW de 0,45% par rapport à l’extrait intracellulaire. Ces résultats démontrent que dans le processus d’extraction du fluide intercellulaire, la perturbation intracellulaire est minime, que la méthodologie a été réalisée correctement et a été utile pour l’analyse souhaitée.

Sélection de la méthodologie pour l’extraction du contenu intracellulaire dans les racines declavel

Le contenu enzymatique cellulaire, peut être évalué dans le tissu racinaire total (IFW+simplaste) également appelé extrait brut (EC), ou en séparant d’abord l’IFW et dans le tissu restant pour extraire le contenu intracellulaire (symplaste) (EIn), afin d’obtenir différents extraits : le brut (EC) et l’intracellulaire (EIn) dans lesquels sont déterminées la teneur en protéines et l’activité enzymatique des enzymes sélectionnées.

La figure 3 montre qu’avec les trois procédures d’extraction testées, il est possible d’obtenir des quantités différentielles de protéines à partir des racines. Après l’extraction de l’IFW, les traitements d’extraction ont présenté un comportement similaire dans le tissu total (EC) et dans le tissu restant (EIn), la plus grande quantité de protéines a été extraite avec les procédures qui ont utilisé le tampon phosphate et le tampon phosphate + PVPP, tandis qu’avec la méthode qui a utilisé des lavages précédents avec de l’acétone aux racines (EIn-AC et EC-AC) la plus petite quantité a été extraite.

Le traitement à l’acétone a contribué à la perte d’une forte teneur en protéines, probablement par effet de dénaturation. Le PVPP n’a pas non plus présenté l’effet décrit dans la littérature (22, 23). Les résultats étaient cohérents en termes de contenu protéique, puisque sa valeur dans la CE est approximativement la somme de celle présente dans le contenu intercellulaire et dans l’extrait intracellulaire.

La plus faible quantité de protéines, statistiquement significative, est présentée dans l’IFW, comme prévu, puisque la méthodologie précédemment choisie pour son obtention a été appliquée dans tous ces cas. Les valeurs protéiques présentes dans le CEI obtenu à partir de racines d’œillet (Dianthus caryophyllus L.) sont proches de celles rapportées dans le CEI obtenu dans la pomme de terre de 2 μg/mL (18).

La figure 4 correspond à l’activité protéasique (PRT) déterminée dans les différents extraits obtenus à partir des racines d’œillet. L’activité a été observée à la fois dans les extraits intracellulaires (EIn) correspondant au symplaste et dans les extraits extracellulaires (IFW) correspondant à l’apoplaste. Dans le liquide de lavage intercellulaire (IFW, IFW-PVPP et IFW-AC), des différences significatives ont été observées, mais pas entre tous les traitements. En comparant les trois traitements d’extraction évalués dans le matériel végétal restant (EIn), après extraction du liquide de lavage intercellulaire, et dans le tissu racinaire total (EC), il a été observé que l’activité la plus élevée correspond à l’extrait obtenu avec un traitement préalable de lavage à l’acétone (EIn-AC). Ce fait est attribué au fait que le traitement à l’acétone peut stabiliser l’enzyme ou permet d’obtenir un extrait enzymatique plus pur, en raison de la réduction de l’eau et des pigments végétaux (31-33).

Des valeurs similaires (Figure 5) ont été trouvées dans l’activité de la lyase du spectrate (PL) dans les différents extraits, sauf pour l’extrait brut préalablement traité avec des poudres d’acétone (EC-AC), où l’activité était statistiquement plus élevée, en raison de l’extraction du contenu total de la cellule et d’une possible stabilisation de l’enzyme avec ce traitement (32, 33), fait qui ne se présente pas lorsqu’on effectue le même traitement sur le matériel résiduel après l’extraction de l’IFW. Parmi les enzymes analysées, c’est la seule qui présente une activité accrue par l’ajout de PVPP au tampon d’extraction, bien que, si l’on compare avec la méthode qui utilise uniquement le tampon, il n’y ait pas de différences majeures.

L’activité polygalacturonase (PG) (Figure 6) a été observée dans tous les extraits testés (IFW, EIn et EC), Ses valeurs sont similaires à celles obtenues dans l’extrait intracellulaire (EIn) et dans l’extrait total (EC). Dans l’extraction de l’enzyme PG intracellulaire (EIn et EC), le traitement qui a le mieux fonctionné est celui qui a utilisé le tampon phosphate, tandis que l’activité la plus faible a été présentée dans les extraits qui ont été préalablement traités avec de l’acétone (EIn-C et EC-C). Cela pourrait indiquer que ce traitement ne stabilise ni n’extrait l’enzyme, mais qu’il pourrait plutôt la dénaturer.

L’utilisation d’acétone et de PVPP dans l’extrait brut et dans l’extrait intracellulaire diminue l’activité enzymatique (PG), ce qui indique que ces traitements, couramment utilisés pour éliminer les composés phénoliques interférents, ne sont pas efficaces car ils affectent la stabilité de l’extrait et donc la quantité d’enzyme.

Pour l’enzyme xylanase (XL) (figure 7), un comportement similaire des extrants à celui observé dans le cas du PG (figure 6) a été présenté, c’est-à-dire que les niveaux d’activité les plus élevés ont été observés lorsque l’extraction a été réalisée avec un tampon phosphate et les plus faibles lorsque l’acétone a été utilisée. Cela indique que ces traitements visant à éliminer les composés phénoliques interférents affectent la stabilité (23, 33), et donc la quantité d’enzymes ou d’interférences présentes dans la méthode de détection. L’activité plus élevée trouvée pour l’enzyme étudiée dans l’extrait brut traité avec un tampon phosphate (EC) correspond approximativement à la somme des activités entre le fluide intercellulaire (IFW) et l’extrait intracellulaire traité avec un tampon phosphate (EIn). Pour les échantillons traités au PVPP et à l’acétone, cette concordance n’est pas observée, ce qui indique des pertes dans l’extraction du tissu total. Les méthodes d’extraction utilisées pour chaque tissu présentaient des différences statistiques, comportement qui n’avait pas été observé pour les autres enzymes où l’extraction avec des phosphates tampons et des phosphates tampons + PVPP présentait des niveaux similaires.

Les résultats ci-dessus indiquent que le prétraitement à l’acétone des racines d’œillet, bien qu’il favorise l’extraction de l’EPR, génère dans d’autres cas une diminution significative de l’activité. Le PVPP diminue l’activité des enzymes PG et XL et, dans une moindre mesure, celle des enzymes PRT et PL, par rapport au traitement utilisant uniquement le tampon phosphate. Cependant, cette diminution est moindre que lorsque l’acétone est utilisée.

Ces résultats constituent une contribution à la sélection d’une méthodologie d’extraction d’une enzyme spécifique des racines d’œillet. Cependant, si l’intérêt est dirigé vers l’étude des quatre enzymes simultanément, l’utilisation du tampon phosphate comme extractant est recommandée, car elle permet d’obtenir plusieurs enzymes en une seule étape et, ainsi, une analyse comparative de l’activité enzymatique.

Il est important de noter que cette étude rapporte pour la première fois les niveaux d’activité des enzymes lytiques PRT, PL, PG et XL dans les racines d’œillets, aussi bien dans l’apoplaste que dans le symplaste.

Dans l’IFW, différents niveaux d’activité sont trouvés pour les enzymes étudiées, les plus élevés pour les enzymes PG, XL et PRT et les plus bas pour l’enzyme PL. Ces enzymes sont également présentes au niveau intracellulaire avec des niveaux qui varient en fonction de la méthode d’extraction. Ces niveaux d’activité peuvent avoir une variation lorsqu’un pathogène pénètre dans la plante et utilise ces mêmes enzymes dans le processus de colonisation (8).

Conclusions

Avec les résultats présentés dans l’article, il a été déterminé les effets de différentes solutions extractantes dans l’activité des enzymes PG, PL, XL, PRT, présentes dans le symplaste des racines d’œillet. Une méthodologie simple et peu polluante a été proposée, qui permet d’extraire les quatre enzymes étudiées en une seule étape et ainsi de déterminer des niveaux d’activité comparatifs. Une méthodologie a été sélectionnée pour extraire l’IFW dans le même tissu, avec une contamination minimale du contenu intracellulaire. Les niveaux des quatre enzymes dans l’apoplaste, dans le symplaste et dans l’extrait total des racines d’œillet ont été déterminés.

Reconnaissance

Les auteurs remercient l’Université nationale de Colombie, Faculté des sciences, et la Division de la recherche qui a soutenu le développement du travail, à travers le projet approuvé avec le code HERMES 20692.

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